ophthalmologyОфтальмологияOphthalmology in Russia1816-50952500-0845Ophthalmology10.18008/1816-5095-2017-1-59-66ophthalmology-355Research ArticleОФТАЛЬМОФАРМАКОЛОГИЯPHARMACOLOGYОценка цитотоксичности слезозаместительных препаратов с использованием системы in vitroCytotoxicity Evaluation of Tear Substitutes Using in vitro SystemАлександроваО. И.AleksandrovaO. I.

младший научный сотрудник, отдел клеточных культур, лаборатория биологии клетки в культуре, группа клеточной биотехнологии,

Тихорецкий пр. 4, Санкт-Петербург, 194064

Junior research scientist, Department of cell cultures, Laboratory of cell biology in culture, Group of cell biotechnology,

Tikhoretsky ave. 4, St-Petersburg, 194064

ОколовИ. Н.OkolovI. N.

к.м.н., заведующий клинико-бактериологической лабораторией,

 ул. Я.Гашека, 21, Санкт-Петербург, 192283

PhD, Head of the Clinical Bacteriological Laboratory,

 21Y. Gasheka st., Saint-Petersburg, 192283

oko99@mail.ruХорольскаяЮ. И.KhorolskayaYu. I.

лаборант-исследователь, отдел клеточных культур, лаборатория биологии клетки в культуре, группа клеточной биотехнологии,

Тихорецкий пр. 4, Санкт-Петербург, 194064

laboratory assistant-scientist, Department of cell cultures, Laboratory of cell biology in culture, Group of cell biotechnology,

Tikhoretsky ave. 4, St-Petersburg, 194064

ПановаИ. Е.PanovаI. E.

д.м.н., профессор, зам. директора по научной работе,

 ул. Я.Гашека, 21, Санкт-Петербург, 192283

MD, professor,Vice-director,

 21Y. Gasheka st., Saint-Petersburg, 192283

БлиноваМ. И.BlinovaM. I.

к.б.н., ведущий научный сотрудник отдела клеточных культур, лаборатория биологии клетки в культуре, группа клеточной биотехнологии,

Тихорецкий пр. 4, Санкт-Петербург, 194064

PhD, leading research scientist, Department of cell cultures, Laboratory of cell biology in culture, Group of cell biotechnology, 

Tikhoretsky ave. 4, St-Petersburg, 194064

ФГБУН институт цитологии РАН, Санкт-ПетербургРоссияInstitute of Cytology of the Russian Academy of Science, Saint PetersburgRussian FederationСанкт-Петербургский филиал ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова МЗ РФРоссияSv. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State InstitutionRussian Federation2017300320171415966Copyright © Александрова О.И., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Панова И.Е., Блинова М.И., 20172017Александрова О.И., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Панова И.Е., Блинова М.И.Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Khorolskaya Y.I., Panovа I.E., Blinova M.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.ophthalmojournal.com/opht/article/view/355Цель

Цель: Анализ цитотоксического действия слезозаместительных глазных капель с различными консервантами и без них на эпителиальные клетки конъюнктивы и роговицы в условиях in vitro.

Материалы и методы

Материалы и методы. Объектом исследования явились семь слёзозаместительных препаратов: Хилабак®, Теалоз®, Систейн Ультра®, Катионорм®, Офтолик®, Артелак® Баланс, Оптив®. В качестве тест-систем были использованы трансформированные клетки нормальных тканей глаза: постоянные трансформированные клеточные линии конъюнктивы (Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4) и роговицы (HCEC) человека. Цитотоксичность «искус- ственных слез» оценивали по жизнеспособности клеток, культивируемых в питательных средах, содержащих в своём составе исследуемые препараты в концентрации 1, 5 и 10%. О жизнеспособности клеток судили по их морфологии и метаболической активности.

Результаты

Результаты. Наибольшую чувствительность к действию исследуемых слезозаместителей показала тест-система на основе клеток роговицы человека. Четыре из семи исследуемых препаратов (Артелак® Баланс, Оптив®, Катионорм®, Офтолик®) в концентрации 10% от объема питательной среды проявили высокую степень токсичности в отношении клеток роговицы. Глазные капли Систейн Ультра® оказали умеренное токсическое действие на клетки роговицы и конъюнктивы в концентрации 5 и 10% от объема питательной среды. Слезозаместители Хилабак® и Теалоз® в этой концентрации не оказали цитотоксического действия на клетки ни одной тест-системы и показали наилучшие результаты при исследовании. Независимо от концентрации, наиболее токсичными для всех типов клеток оказались препараты Офтолик® и Артелак® Баланс.

Заключение

Заключение. Установлена прямая зависимость между концентрацией исследуемых препаратов в питательной среде и их цитотоксичностью. Глазные капли Хилабак® и Теалоз®, не содержащие в своем составе консервант, не оказывали цитотоксическое действие на клетки обеих тест-систем при всех используемых концентрациях. Наименьшим токсическим эффектом из тестируемых слезозаместителей с «мягким» консервантом обладали глазные капли Систейн Ультра®, содержащие Поликвад®. Среди «искусственных слез» наибольшее токсическое действие на все типы клеток при всех используемых концентрациях было отмечено у глазных капель Офтолик (БАК 0,01%) и Артелак® Баланс (Оксид). Проведённые исследования показали принципиальную возможность использования систем in vitro для сравнительной оценки цитотоксического действия слезозаместителей. 

Objective

Objective. The objective of the study is to evaluate in vitro the cytotoxic effect of different moisture eye drops (containing or without preservatives) on the epithelial cells of the conjunctiva and the cornea.

Materials and methods

Materials and methods. The objects of the study are moisture eye drops: Hylabak®, Thealoz®, Sistane Ultra®, Kationorm®, Oftolik®, Artelak® Balance, Optiv®. As test systems there were used the transformed cells of normal eye tissues: constant conjunctiva transformed cell lines (Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4) and the human cornea (HCEC). The cytotoxicity of the “artificial tears” was assessed by the viability of cells, cultured in substratum containing the solutions of the objects at concentrations 1, 5 and 10%. Cell viability was assessed by their morphology and metabolic activity.

Results

Results. The most sensitive to the investigated eye drops is considered to be the test system based on human corneal cells. Four of the seven investigated eye drops (Artelak® Balance, Optiv®, Kationorm®, Oftolik®) at a concentration of 10% (by volume) of the substratum showed a high degree of toxicity for cornea cells. Eyedrops Sistane Ultra® had moderate toxic effect on the cells of the cornea and conjunctiva at concentration 5 and 10% (by volume). Hylabak® and Thealoz® in this concentrations did not have any cytotoxic effect on the cells of all test system and showed the best results in the research. The most toxic of all cell types were eye drops Oftolik® and Artelak® balance.

Conclusion

Conclusion. A direct relationship between the concentration of drug in culture medium and cell cytotoxicity was investigated. Eye drops Hylabak® and Thealoz®, that do not contain in its composition a preservative, had no cytotoxic effect on the cells of both test systems at all concentrations used. The lowest toxic effect of the test had eye drop Sistane Ultra® containing “soft” preservative Poliquad®. Among the “artificial tears”, the greatest toxic effect on all cell types at all concentrations used, was observed in eye drops Oftolik (BAK 0.01%) and balance Artelak® (containing “soft” preservative Oxide). Studies have shown the possibility of using in vitro cell systems for the comparative evaluation of the cytotoxic effect of mousture eye drops. 

клеточные культурыконъюнктиваконсерванты«искусственная слеза»роговицацитотоксичностьэпителий глазной поверхностисell culturesconjunctivapreservativesartificial tearscorneacytotoxicityocular surface epitheliumРНФReferencesTsubota K., Kawashima M., Inaba T. The antiaging approach for the treatment of dry eye. Cornea. 2012;31:1:3–8. DOI:10.1097/ICO.0b013e31826a05a8Tsubota K., Kawashima M., Inaba T. The antiaging approach for the treatment of dry eye. Cornea. 2012;31:1:3–8. DOI:10.1097/ICO.0b013e31826a05a8Versura P., Profazio V., Giannaccare G. Discomfort symptoms reduction and ocular surface parameters recovery with Artelac Rebalance treatment in mild–moderate dry eye. Europ. J. Ophthalmol. 2013;23:4:488–495. DOI:10.5301/ejo.5000267Versura P., Profazio V., Giannaccare G. Discomfort symptoms reduction and ocular surface parameters recovery with Artelac Rebalance treatment in mild–moderate dry eye. Europ. J. Ophthalmol. 2013;23:4:488–495. DOI:10.5301/ejo.5000267Bron A., Tomlinson A., Foulks G., Pepose J., Baudouin C., Geerling G. Rethinking dry eye disease: a perspective on clinical implications. Ocul Surf. 2014;12:1-31. DOI: 10.1016/j.jtos.2014.02.002Bron A., Tomlinson A., Foulks G., Pepose J., Baudouin C., Geerling G. Rethinking dry eye disease: a perspective on clinical implications. Ocul Surf. 2014;12:1-31. DOI: 10.1016/j.jtos.2014.02.002Brzheskij V. V., Kalinina I. V., Popov V. Yu. [New possibilities of drug therapy of patients with corneal conjunctival xerosis]. [Clinical Ophthalmology]. Klinicheskaya oftal'mologiya. 2016;1:39-46. (In Russ.).Brzheskij V. V., Kalinina I. V., Popov V. Yu. [New possibilities of drug therapy of patients with corneal conjunctival xerosis]. [Clinical Ophthalmology]. Klinicheskaya oftal'mologiya. 2016;1:39-46. (In Russ.).Baudouin C., Labbé A., Liang H., Pauly A., Brignole-Baudouin F. Preservatives in eye drops: the good, the bad and the ugly. Prog Retin Eye Res. 2010; 9:312-334. DOI: 10.1016/j.preteyeres.2010.03.001.Baudouin C., Labbé A., Liang H., Pauly A., Brignole-Baudouin F. Preservatives in eye drops: the good, the bad and the ugly. Prog Retin Eye Res. 2010; 9:312-334. DOI: 10.1016/j.preteyeres.2010.03.001.Epstein S., Ahdoot M., Marcus E., Asbell P. Comparative toxicity of preservatives on immortalized corneal and conjunctival epithelial cells. J Ocul Pharmacol Ther. 2009; 25:113-119. DOI: 10.1089/jop.2008.0098.Epstein S., Ahdoot M., Marcus E., Asbell P. Comparative toxicity of preservatives on immortalized corneal and conjunctival epithelial cells. J Ocul Pharmacol Ther. 2009; 25:113-119. DOI: 10.1089/jop.2008.0098.Whitson J., Petroll W. Corneal epithelial cell viability following exposure to ophthalmic solutions containing preservatives and/or antihypertensive agents. Adv Ther. 2012;29:874-888. DOI: 10.1007/s12325-012-0057-1Whitson J., Petroll W. Corneal epithelial cell viability following exposure to ophthalmic solutions containing preservatives and/or antihypertensive agents. Adv Ther. 2012;29:874-888. DOI: 10.1007/s12325-012-0057-1Wilson W., Duncan A., Jay J.. Effect of benzalkonium chloride on the stability of the precorneal tear film in rabbit and man. Br J Ophthalmol. 1975;59:11:667-669.Wilson W., Duncan A., Jay J.. Effect of benzalkonium chloride on the stability of the precorneal tear film in rabbit and man. Br J Ophthalmol. 1975;59:11:667-669.Danchenko E.O. [Assessment of cytotoxicity pharmaceuticals using cell cultures] Otsenka tsitotoksichnosti farmatsevticheskikh substantsiy s ispol'zovaniem kletochnykh kul'tur. [Immunology, Allergology, Infectology]. Immunopatologiya, Allergologiya, Infektologiya 2012;2: 22-31. (In Russ.).Danchenko E.O. [Assessment of cytotoxicity pharmaceuticals using cell cultures] Otsenka tsitotoksichnosti farmatsevticheskikh substantsiy s ispol'zovaniem kletochnykh kul'tur. [Immunology, Allergology, Infectology]. Immunopatologiya, Allergologiya, Infektologiya 2012;2: 22-31. (In Russ.).Drozdov F.V., Mekhtiev A.R., Morozevich G.E., Timofeev V.P., Misharin A.Yu. [Cytotoxic derivatives (22R, 23R) — digidroxsistigmastana]. Tsitotoksichnye proizvodnye (22R, 23R) — digidroksistigmastana. [Bioorgan. Chemistry]. Bioorgan. khimiya. 2007; 33: 349-356. (In Russ.).Drozdov F.V., Mekhtiev A.R., Morozevich G.E., Timofeev V.P., Misharin A.Yu. [Cytotoxic derivatives (22R, 23R) — digidroxsistigmastana]. Tsitotoksichnye proizvodnye (22R, 23R) — digidroksistigmastana. [Bioorgan. Chemistry]. Bioorgan. khimiya. 2007; 33: 349-356. (In Russ.).Eropkin M.Ju., Eropkina E.M. The cell cultures as a model system toxicity studies and screening of cytoprotective drugs. — SPb.: Morsar AV, 2003. (In Russ.).Eropkin M.Ju., Eropkina E.M. The cell cultures as a model system toxicity studies and screening of cytoprotective drugs. — SPb.: Morsar AV, 2003. (In Russ.).Romanova S.G., Serebrennikova G.A., Shtil' A.A. [Synthesis and study of properties of cytotoxic and hemolytic activity of cationic glycerolipids alkyl type]. Sintez, izuchenie tsitotoksicheskikh svoystv i gemoliticheskoy aktivnosti kationnykh glitserolipidov alkil'nogo tipa. [Annals of Moscow Technological University]. Vestnik Moskovskogo tekhnologicheskogo universtiteta. 2008;3:5:101-105. (In Russ.).Romanova S.G., Serebrennikova G.A., Shtil' A.A. [Synthesis and study of properties of cytotoxic and hemolytic activity of cationic glycerolipids alkyl type]. Sintez, izuchenie tsitotoksicheskikh svoystv i gemoliticheskoy aktivnosti kationnykh glitserolipidov alkil'nogo tipa. [Annals of Moscow Technological University]. Vestnik Moskovskogo tekhnologicheskogo universtiteta. 2008;3:5:101-105. (In Russ.).Anikina L.V., Puhov S.A., Dubrovskaja E.S., Afanas'eva S.V., Klochkov S.G. [Comparative determination of cell viability using the MTT and Resazurin]. Sravnitel'noe opredelenie zhiznesposobnosti kletok s pomoshch'yu mtt i resazurina. [Fundamental research]. Fundamental'nye issledovaniya. 2014; 12: 1423-1427. (In Russ.).Anikina L.V., Puhov S.A., Dubrovskaja E.S., Afanas'eva S.V., Klochkov S.G. [Comparative determination of cell viability using the MTT and Resazurin]. Sravnitel'noe opredelenie zhiznesposobnosti kletok s pomoshch'yu mtt i resazurina. [Fundamental research]. Fundamental'nye issledovaniya. 2014; 12: 1423-1427. (In Russ.).Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Tahtaev Ju.V., Horol'skaja Ju.I., Hintuba T.S., Blinova M.I. [Comparative evaluation of the cytotoxicity of antimicrobial eye drops]. Sravnitel'naya otsenka tsitotoksichnosti antimikrobnykh glaznykh kapel'. [Ophthalmology journal]. Oftal'mologicheskie vedomosti. 2015;8:1:89-97. (In Russ.).Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Tahtaev Ju.V., Horol'skaja Ju.I., Hintuba T.S., Blinova M.I. [Comparative evaluation of the cytotoxicity of antimicrobial eye drops]. Sravnitel'naya otsenka tsitotoksichnosti antimikrobnykh glaznykh kapel'. [Ophthalmology journal]. Oftal'mologicheskie vedomosti. 2015;8:1:89-97. (In Russ.).Aleksandrova O.I., Horol'skaja Ju.I., Majchuk D.Ju., Blinova M.I. [The study of general cytotoxicity of aminoglycoside antibiotics and fluoroquinolone in cell cultures]. Issledovanie obshchey tsitotoksichnosti antibiotikov aminoglikozidnogo i ftorkhinolonovogo ryada na kletochnykh kul'turakh. [Annals of Ophthalmology]. Vestnik oftal'mologii 2015;5:39-48. (In Russ.).Aleksandrova O.I., Horol'skaja Ju.I., Majchuk D.Ju., Blinova M.I. [The study of general cytotoxicity of aminoglycoside antibiotics and fluoroquinolone in cell cultures]. Issledovanie obshchey tsitotoksichnosti antibiotikov aminoglikozidnogo i ftorkhinolonovogo ryada na kletochnykh kul'turakh. [Annals of Ophthalmology]. Vestnik oftal'mologii 2015;5:39-48. (In Russ.).Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Horol'skaja Ju.I., Blinova M.I., Churakov T.K. [Assessing the impact of benzalkonium chloride and cytotoxicity Nettatsin Tobrex eyedrops under conditions in vitro]. Otsenka vliyaniya benzalkoniya khlorida na tsitotoksichnost' glaznykh kapel' Nettatsin i Tobreks v usloviyakh in vitro. [Modern technologies in ophthalmology]. Sovremennye tekhnologii v oftal'mologii. 2016;3:163-166. (In Russ.).Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Horol'skaja Ju.I., Blinova M.I., Churakov T.K. [Assessing the impact of benzalkonium chloride and cytotoxicity Nettatsin Tobrex eyedrops under conditions in vitro]. Otsenka vliyaniya benzalkoniya khlorida na tsitotoksichnost' glaznykh kapel' Nettatsin i Tobreks v usloviyakh in vitro. [Modern technologies in ophthalmology]. Sovremennye tekhnologii v oftal'mologii. 2016;3:163-166. (In Russ.).Vechkanov E.M., Sorokina I.A. [Basics of Cell Engineering, Rostov-on-Don]. 2012. (In Russ.).Vechkanov E.M., Sorokina I.A. [Basics of Cell Engineering, Rostov-on-Don]. 2012. (In Russ.).Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Meth. 1983;65:1–2:55–63.Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Meth. 1983;65:1–2:55–63.Cancer cell culture: methods and protocols / Ser. Methods in Molecular Medicine. (Ed. S.P. Langdon). Totowa, NJ: Humana Press, 2003; 88:165-169.Cancer cell culture: methods and protocols / Ser. Methods in Molecular Medicine. (Ed. S.P. Langdon). Totowa, NJ: Humana Press, 2003; 88:165-169.In vitro toxicity testing protocols / Ser. Methods in Molecular Biology. Vol. 43. (Eds S.O’Hare, C.K. Atterwill). Totowa, NJ: Humana Press, 1995;43:138–149.In vitro toxicity testing protocols / Ser. Methods in Molecular Biology. Vol. 43. (Eds S.O’Hare, C.K. Atterwill). Totowa, NJ: Humana Press, 1995;43:138–149.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.