ophthalmologyОфтальмологияOphthalmology in Russia1816-50952500-0845Ophthalmology10.18008/1816-5095-2018-2-182-188ophthalmology-605Research ArticleКЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯCLINICAL & EXPERIMENTAL RESEARCHНовые свойства слезозаместителя, содержащего гепарин, в условиях in vitro (потенциальный противовирусный и противовоспалительный эффект)New Properties of the Heparin-Containing Drug in vitro (Potential Antiviral and Anti-Inflammatory Effects)ЧернаковаГ. М.ChernakovaG. M.

Бескудниковский бульвар, 59а, Москва, 127486, Российская Федерация

кандидат медицинских наук, доцент

Beskudnikovsky blvd, 59a, Moscow 127486, Russia

PhD, docent

chernakova111@yandex.ruМайчукД. Ю.MaychukD. Yu.

Бескудниковский бульвар, 59а, Москва, 127486, Российская Федерация

доктор медицинских наук, руководитель терапевтического отдела

Beskudnikovsky blvd, 59a, Moscow 127486, Russia

MD, head of therapy department

СлонимскийЮ. Б.SlonimskyYu. B.

ул. Баррикадная, 2/1, Москва, 123995, Российская Федерация

доктор медицинских наук, профессор

Barrikadnaya str., 2/1, Moscow, 125993, Russia

MD, professor

СлонимскийА. Ю.SlonimskiyA. Yu.

Семеновский пер., 11, Москва, 107023, Российская Федерация

доктор медицинских наук, профессор

Semenovskii lane, 11, Moscow, 107023, Russia

MD, professor

КлещеваЕ. А.KleshchevaE. A.

ул. Баррикадная, 2/1, Москва, 123995, Российская Федерация

кандидат медицинских наук

Barrikadnaya str., 2/1, Moscow, 125993, Russia

PhD

МезенцеваМ. В.MezentsevaM. V.

ул. Гамалеи, 18, Москва, 123098, Российская Федерация

доктор биологических наук, заведующая лабораторией

Gamalei str., 18, Moscow, 123098, Russia

doctor of biol. sci., head of the laboratory

ФГАУ «МНТК “Микрохирургия глаза” им. академика С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияThe S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State InstitutionRussian FederationФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияRussian Medical Academy of Continuous Professional EducationRussian FederationМосковская глазная клиникаРоссияMoscow Ophthalmology ClinicRussian FederationФГБОУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияFederal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after N.F. GamaleyaRussian Federation201805072018152182188Copyright © Чернакова Г.М., Майчук Д.Ю., Слонимский Ю.Б., Слонимский А.Ю., Клещева Е.А., Мезенцева М.В., 20182018Чернакова Г.М., Майчук Д.Ю., Слонимский Ю.Б., Слонимский А.Ю., Клещева Е.А., Мезенцева М.В.Chernakova G.M., Maychuk D.Y., Slonimsky Y.B., Slonimskiy A.Y., Kleshcheva E.A., Mezentseva M.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.ophthalmojournal.com/opht/article/view/605Цель

Цель: изучить цитотоксический, иммунологический и противовирусный эффект препарата хилопарин-комод® in vitro.

Материал и методы

Материал и методы. Для работы использовали перевиваемые культуры нормальных клеток конъюнктивы человека Chang conjunctiva и клеток почки обезьян Vero.  Цитотоксическое действие препарата хилопарин-комод® определяли по влиянию на  жизнеспособность клеток и оптической плотности (ОП) монослоя культуры клеток Chang  conjunctiva методом иммуноферментного анализа (ИФА) с МТТ. Влияние препарата на  функциональную активность клеток конъюнктивы оценивали по продукции цитокинов на уровне их транскрипции in vitro. Противовирусное действие препарата хилопаринкомод® изучали на линии клеток Vero, инфицированных вирусом простого  герпеса тип 1 (ВПГ-1) и ВПГ тип 2 (ВПГ-2). Вирусную активность ВПГ-1 и ВПГ-2 и  противогерпетический эффект после воздействия препарата оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Результаты

Результаты. Значительного цитотоксического влияния на метаболизм клеток конъюнктивы  препарата хилопарин-комод® в разведениях от 1/2 до 1/2048 не выявлено (по сравнению с  контролем). Воздействие препарата в разведениях 1/40 и 1/1000 на культуру клеток конъюнктивы приводило к подавлению продукция мРНК интерферона λ-1 (ИФНλ-1) и мРНК ИФНλ-2 по сравнению с контролем. В разведении препарата 1/1000 не определялась  продукция мРНК интерлейкина-6 (ИЛ-6) при одновременном наличии мРНК ИЛ-10. В  различных разведениях препарата количество копий вирусной ДНК ВПГ-1 снижалось по  сравнению с контролем во всех случаях, наибольший противовирусный эффект достигнут в  разведении 1:2. Воздействие препарата хилопарин-комод® на культуру клеток, зараженных ВПГ-2, в разведениях 1:2 и 1:5 приводило к снижению уровня репликации вируса в 300 и  40 раз, соответственно.

Заключение

Заключение. Препарат хилопарин-комод® обладает противовоспалительным эффектом, проявляющимся в подавлении синтеза мРНК острофазного провоспалительного цитокина  ИЛ-6 и стимуляции продукции мРНК противовоспалительного ИЛ-10, не оказывая при этом  цитотоксического действия на клетки конъюнктивы. Доказанный противовирусный эффект препарата позволяет рекомендовать включение хилопарин-комод® в схему терапии пациентов с вирусной офтальмопатологией.

Purpose

Purpose: to study the cytological, immunological and antiviral effects of the HILOPARIN-KOMOD® drug in vitro.

Material and methods

Material and methods. We used transplantable cultures of normal cells of the human Chang conjunctiva, and the kidney cells of the Vero monkeys. The cytotoxic effect of the HILOPARIN-KOMOD® was  determined by the effect on the cell viability, and by optical density  (OP) of the monolayer of the Chang conjunctiva cell culture using the enzyme immunoassay (ELISA) with MTT. The effect of the drug on  the functional activity of conjunctival cells was evaluated by the  production of cytokines at the level of their in vitro transcription. The antiviral effect of the drug HILOPARIN-KOMOD® was studied on  the Vero cell line infected with herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and HSV type 2 (HSV-2). The viral activity of HSV-1 and HSV-2  and the antiherpetic effect after the drug was evaluated by  polymerase chain reaction (PCR). 

Results

Results. No significant cytotoxic effect on the metabolism of conjunctival cells of the preparation HILOPARINKOMOD ® in  dilutions from 1/2 to 1/2048 was revealed (in comparison with the  control). The effect of the drug in dilutions of 1/40 and 1/1000 on  the culture of the conjunctival cells resulted in suppression of the  production of interferon λ-1 mRNA (IFNλ-1) and IFNλ-2 mRNA  compared to the control. In the dilution of preparation 1/1000, the  production of mRNA of interleukin-6 (IL-6) was not revealed with  simultaneous presence of IL-10 mRNA. In different dilutions of the  drug, the number of copies of HSV-1 virus DNA decreased in  comparison with the control in all cases, the greatest antiviral effect  was achieved in a 1: 2 dilution. The effect of the preparation  HILOPARIN-KOMOD® on the culture of cells infected with HSV-2 in  dilutions of 1: 2 and 1: 5 led to a decrease in the level of viral replication by 300 and 40 times, respectively.

The conclusion

The conclusion. The drug HILOPARIN-KOMOD® has an anti-inflammatory effect that manifests itself in suppressing the synthesis of the mRNA of the acute phase proinflammatory cytokine IL-6 and  stimulating the production of anti-inflammatory IL-10 mRNA, without having a cytotoxic effect on conjunctival cells. The proven antiviral  effect of the drug makes it possible to recommend the inclusion of  HILOPARIN-KOMOD® in the scheme of therapy of patients with viral ophthalmopathology.

клеточные культурыцитотоксичностьклетки конъюнктивы человекацитокинывирус простого герпесапротивовирусный эффектхилопарин-комод®cell culturescytotoxicityhuman conjunctival cellscytokinesherpes simplex virusantiviral effectHILOPARINKOMOD ®ReferencesСуббот А.М., Габашвили А.Н., Нестерова Т.В. Первичные культуры клеток из ткани роговицы как тест-системы для оценки действия офтальмологических препаратов и материал для изучения патогенеза заболеваний in vitro. Точка зрения. Восток — Запад. 2017;3:90–94. [Subbot A.M., Gabashvili A.N., Nesterova T.N.[Cornea primary cell culture as test systems for assessment ophthalmological drugs and material for studyof disease pathogenesis in vitro. East-Vest=Tochka zreniya. Vostok — Zapad. 2017;3:90–94. (In Russ.)]Суббот А.М., Габашвили А.Н., Нестерова Т.В. Первичные культуры клеток из ткани роговицы как тест-системы для оценки действия офтальмологических препаратов и материал для изучения патогенеза заболеваний in vitro. Точка зрения. Восток — Запад. 2017;3:90–94. [Subbot A.M., Gabashvili A.N., Nesterova T.N.[Cornea primary cell culture as test systems for assessment ophthalmological drugs and material for studyof disease pathogenesis in vitro. East-Vest=Tochka zreniya. Vostok — Zapad. 2017;3:90–94. (In Russ.)]Суетина И.А., Чернакова Г.М., Майчук Д.Ю., Руссу Л.И., Клещева Е.А., Муртазалиева С.М., Мезенцева М.В. Оценка влияния комбинации офтальмологических препаратов на культуру клеток конъюнктивы человека (chang conjunctiva). Офтальмология. 2017;14(4):368–374. [Suetina I.A., Chernakova G.M., Maychuk D.Y., Mezentseva M.V., Russu L.I., Kleshcheva E.A., Murtazalieva S.M. Evaluation of the effect of the ophthalmic remedies combination on the viability of human conjunctival cell culture chang conjunctiva]. Ophthalmology in Russia= Oftal’mologiya. 2017;14(4):368–374. (In Russ.)] DOI: 10.18008/1816-5095-2017-4-368-374Суетина И.А., Чернакова Г.М., Майчук Д.Ю., Руссу Л.И., Клещева Е.А., Муртазалиева С.М., Мезенцева М.В. Оценка влияния комбинации офтальмологических препаратов на культуру клеток конъюнктивы человека (chang conjunctiva). Офтальмология. 2017;14(4):368–374. [Suetina I.A., Chernakova G.M., Maychuk D.Y., Mezentseva M.V., Russu L.I., Kleshcheva E.A., Murtazalieva S.M. Evaluation of the effect of the ophthalmic remedies combination on the viability of human conjunctival cell culture chang conjunctiva]. Ophthalmology in Russia= Oftal’mologiya. 2017;14(4):368–374. (In Russ.)] DOI: 10.18008/1816-5095-2017-4-368-374Антонов А.А., Макарова А.С., Рещикова В.С. Экспериментальные исследования эффективности ретиналамина. Национальный журнал глаукома. 2017;16(3):98–102. [Antonov A.A., Makarova A.S., Reshchikova V.S. Experimental studies of Retinalamin efficacy. National Journal glaucoma=Natsional’nyi zhurnal glaukoma. 2017;16(3):98–102. (In Russ.)]Антонов А.А., Макарова А.С., Рещикова В.С. Экспериментальные исследования эффективности ретиналамина. Национальный журнал глаукома. 2017;16(3):98–102. [Antonov A.A., Makarova A.S., Reshchikova V.S. Experimental studies of Retinalamin efficacy. National Journal glaucoma=Natsional’nyi zhurnal glaukoma. 2017;16(3):98–102. (In Russ.)]Александрова О.И., Околов И.Н., Тахтаев Ю.В., Хорольская Ю.И., Хинтуба Т.С., Блинова М.И. Сравнительная оценка цитотоксичности антимикробных глазных капель. Офтальмологические ведомости. 2015;8(1):89–97. [Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Takhtaev Yu.V., Khorolskaya Ju.I., Hintuba T.S., Blinova M.I. A comparative evaluation of antimicrobial eye drops cytotoxicity. Ophthalmology journal=Oftal’mologicheskie vedomosti. 2015;8(1):89–97. (In Russ.)]Александрова О.И., Околов И.Н., Тахтаев Ю.В., Хорольская Ю.И., Хинтуба Т.С., Блинова М.И. Сравнительная оценка цитотоксичности антимикробных глазных капель. Офтальмологические ведомости. 2015;8(1):89–97. [Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Takhtaev Yu.V., Khorolskaya Ju.I., Hintuba T.S., Blinova M.I. A comparative evaluation of antimicrobial eye drops cytotoxicity. Ophthalmology journal=Oftal’mologicheskie vedomosti. 2015;8(1):89–97. (In Russ.)]Тахтаев Ю.В., Хинтуба Т.С., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Александрова О.И., Блинова М.И. Количественная и качественная оценка цитотоксичности антибактериальных глазных капель фторхинолонового ряда in vitro. Вестник образования и развития науки Российской академии естественных наук. 2016;2:83–90. [Takhtaev Yu.V., Khintuba T.S., Okolov I.N., Khorolskaya Yu.I., Aleksandrova O.I., Blinova M.I. Quantitative and qualitative assessment of cytotoxicity of antibacterial eye drops of fluoroquinolones in vitro. Herald of education and science development of Russian Academy of Natural Sciences=Vestnik obrazovaniya i razvitiya nauki Rossiiskoi akademii estestvennykh nauk. 2016;2:83–90. (In Russ.)]Тахтаев Ю.В., Хинтуба Т.С., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Александрова О.И., Блинова М.И. Количественная и качественная оценка цитотоксичности антибактериальных глазных капель фторхинолонового ряда in vitro. Вестник образования и развития науки Российской академии естественных наук. 2016;2:83–90. [Takhtaev Yu.V., Khintuba T.S., Okolov I.N., Khorolskaya Yu.I., Aleksandrova O.I., Blinova M.I. Quantitative and qualitative assessment of cytotoxicity of antibacterial eye drops of fluoroquinolones in vitro. Herald of education and science development of Russian Academy of Natural Sciences=Vestnik obrazovaniya i razvitiya nauki Rossiiskoi akademii estestvennykh nauk. 2016;2:83–90. (In Russ.)]Александрова О.И., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Панова И.Е., Блинова М.И. Оценка цитотоксичности слезозаместительных препаратов с использованием системы in vitro. Офтальмология. 2017;14(1):59–66. [Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Khorolskaya Y.I., Panovа I.E., Blinova M.I. Cytotoxicity Evaluation of Tear Substitutes Using in vitro System. Оphthalmology in Russia=Oftal’mologiya. 2017;14(1):59–66. (In Russ.)] DOI: 10.18008/1816-5095-2017-1-59-6621Александрова О.И., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Панова И.Е., Блинова М.И. Оценка цитотоксичности слезозаместительных препаратов с использованием системы in vitro. Офтальмология. 2017;14(1):59–66. [Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Khorolskaya Y.I., Panovа I.E., Blinova M.I. Cytotoxicity Evaluation of Tear Substitutes Using in vitro System. Оphthalmology in Russia=Oftal’mologiya. 2017;14(1):59–66. (In Russ.)] DOI: 10.18008/1816-5095-2017-1-59-6621Александрова О.И., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Панова И.Е., Блинова М.И. Влияние нестероидных противовоспалительных глазных капель на клетки эпителия роговицы и конъюнктивы человека в условиях in vitro. Офтальмология. 2017;14(3):251– 259. [Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Khorolskaya Y.I., Panovа I.E., Blinova M.I. Influence of non-steroidal antiinflammatory eye drops on the epithelium cells of the cornea and conjunctiva in vitro. Оphthalmology in Russia=Oftal’mologiya. 2017;14(3):251–259. (In Russ.)] DOI: 10.18008/1816-5095-2017-3-251-25922Александрова О.И., Околов И.Н., Хорольская Ю.И., Панова И.Е., Блинова М.И. Влияние нестероидных противовоспалительных глазных капель на клетки эпителия роговицы и конъюнктивы человека в условиях in vitro. Офтальмология. 2017;14(3):251– 259. [Aleksandrova O.I., Okolov I.N., Khorolskaya Y.I., Panovа I.E., Blinova M.I. Influence of non-steroidal antiinflammatory eye drops on the epithelium cells of the cornea and conjunctiva in vitro. Оphthalmology in Russia=Oftal’mologiya. 2017;14(3):251–259. (In Russ.)] DOI: 10.18008/1816-5095-2017-3-251-25922Мейхи Б. Вирусология. Москва :Мир; 1988. [Mahy B.W.J. Virology. Moscow: Mir; 1988. (In Russ.)]Мейхи Б. Вирусология. Москва :Мир; 1988. [Mahy B.W.J. Virology. Moscow: Mir; 1988. (In Russ.)]Davies H.W., Appleyard G., Cunningham P., Pereira M.S. The use of acontinuous cell line for the isolation of influenza viruses. Bull World Health Organ. 1978;56(6):991–3.Davies H.W., Appleyard G., Cunningham P., Pereira M.S. The use of acontinuous cell line for the isolation of influenza viruses. Bull World Health Organ. 1978;56(6):991–3.Chomezynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thyocyoanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 1987;162(1):156–9. DOI: 10.1006/abio.1987.9999Chomezynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thyocyoanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 1987;162(1):156–9. DOI: 10.1006/abio.1987.9999Gelder C.M., Thomas P.S., Yates D.H., Adcock I.M., Morrison J.F., Barnes P.J. Cytokine expression in normal, atopic and asthmatic subject using the combination of sputum induction and the polymerase chain reaction. Thorax. 1995;50(10):1033–7.Gelder C.M., Thomas P.S., Yates D.H., Adcock I.M., Morrison J.F., Barnes P.J. Cytokine expression in normal, atopic and asthmatic subject using the combination of sputum induction and the polymerase chain reaction. Thorax. 1995;50(10):1033–7.Glantz S.A. Primer of Biostatistics. Seventh Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc.;2012.Glantz S.A. Primer of Biostatistics. Seventh Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc.;2012.Ткаченко Н.В., Астахов С.Ю. Опыт применения «Хилопарина» в клинической практике. Офтальмологические ведомости. 2014;7(4):53–62. [Tkachenko N.V., Astakhov S.Yu. The experience of “Hyloparin” use in clinical practice. Ophthalmology journal=Oftal’mologicheskie vedomosti. 2014;7(4):53–62. (In Russ.)]Ткаченко Н.В., Астахов С.Ю. Опыт применения «Хилопарина» в клинической практике. Офтальмологические ведомости. 2014;7(4):53–62. [Tkachenko N.V., Astakhov S.Yu. The experience of “Hyloparin” use in clinical practice. Ophthalmology journal=Oftal’mologicheskie vedomosti. 2014;7(4):53–62. (In Russ.)]Jiang Z., Dong X., Yan X., Liu Y., Zhang L., Sun Y. Nanogels of dual inhibitormodified hyaluronic acid function as a potent inhibitor of amyloid β-protein aggregation and cytotoxicity. Scientific reports. 2018;8(1):3505. DOI: 10.1038/s41598-018-21933-6Jiang Z., Dong X., Yan X., Liu Y., Zhang L., Sun Y. Nanogels of dual inhibitormodified hyaluronic acid function as a potent inhibitor of amyloid β-protein aggregation and cytotoxicity. Scientific reports. 2018;8(1):3505. DOI: 10.1038/s41598-018-21933-6Neuman M.G., Nanau R.M., Oruna-Sanchez L., Coto G. Hyaluronic acid and wound healing. Journal of pharmacy and pharmaceutical sciences. 2015;18(1):53–60.Neuman M.G., Nanau R.M., Oruna-Sanchez L., Coto G. Hyaluronic acid and wound healing. Journal of pharmacy and pharmaceutical sciences. 2015;18(1):53–60.Бокарев И.Н., Попова Л.В. Опыт применения низкомолекулярных гепаринов при лечении тромбоза глубоких вен. Трудный пациент. 2008;6(10):42–48.Бокарев И.Н., Попова Л.В. Опыт применения низкомолекулярных гепаринов при лечении тромбоза глубоких вен. Трудный пациент. 2008;6(10):42–48.[Bokarev I.N., Popova L.V. Experience in the use of low molecular weight heparins in the treatment of deep vein thrombosis. Difficult patient=Trudnyi patsient. 2008;6(10):42–48. (In Russ.)][Bokarev I.N., Popova L.V. Experience in the use of low molecular weight heparins in the treatment of deep vein thrombosis. Difficult patient=Trudnyi patsient. 2008;6(10):42–48. (In Russ.)]Базарный В.В., Михайлова Н.П., Кочурова И.В., Исайкин А.И. Оценка влияния гиалуроновой кислоты на состояние гуморального иммунитета. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2012;2(39):18. [Bazarny V.V., Mikhailova N.P., Kochurova I.V., Isaikin A.I. Asessment of hyaluronic acid effect on humoral immunity. Journal of Ural Medical Academic Science=Vestnik Ural’skoi meditsinskoi akademicheskoi nauki. 2012;2(39):18. (In Russ.)]Базарный В.В., Михайлова Н.П., Кочурова И.В., Исайкин А.И. Оценка влияния гиалуроновой кислоты на состояние гуморального иммунитета. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2012;2(39):18. [Bazarny V.V., Mikhailova N.P., Kochurova I.V., Isaikin A.I. Asessment of hyaluronic acid effect on humoral immunity. Journal of Ural Medical Academic Science=Vestnik Ural’skoi meditsinskoi akademicheskoi nauki. 2012;2(39):18. (In Russ.)]Кетлинский С.А. Симбирцев А.С. Цитокины. Санкт-Петербург: Фолиант, 2008. [Ketlinskii S.A. Simbirtsev A.S. Сytokines. Sankt-Peterburg: Foliant, 2008. (In Russ.)]Кетлинский С.А. Симбирцев А.С. Цитокины. Санкт-Петербург: Фолиант, 2008. [Ketlinskii S.A. Simbirtsev A.S. Сytokines. Sankt-Peterburg: Foliant, 2008. (In Russ.)]Nagataki S., Sugaya M. Methylcellulose and ointment vehicles: their effects on ocular pharmacokinetics. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 1978;82(2):127–34.Nagataki S., Sugaya M. Methylcellulose and ointment vehicles: their effects on ocular pharmacokinetics. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 1978;82(2):127–34.Chrai S.S., Patton T.F., Mehta A., Robinson J.R. Lacrimal and instilled fluid dynamics in rabbit eyes. Journal of pharmaceutical sciences. 1973;62(7):1112–21.Chrai S.S., Patton T.F., Mehta A., Robinson J.R. Lacrimal and instilled fluid dynamics in rabbit eyes. Journal of pharmaceutical sciences. 1973;62(7):1112–21.dynamics in rabbit eyes. Journal of pharmaceutical sciences. 1973;62(7):1112–21.dynamics in rabbit eyes. Journal of pharmaceutical sciences. 1973;62(7):1112–21.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.